تخلیص نسبی آنزیم آلژینات لیاز تولید شده از یک سویه موکوئیدی باکتری pseudomonas aeruginosa جداشده از بیمار

باکتری pseudomonas aeruginosa، یک باکتری گرم منفی، هوازی و میله ای شکل متعلق به خانواده pseudomonadaceae می باشد.. این باکتری به دلیل توانایی بالا در تولید پوشش موکوئیدی حاوی اگزوپلی ساکاریدی به نام آلژینات، عامل اصلی مزمن شدن عفونت مجاری تنفسی و در نتیجه مرگ و میر در بیماران مبتلا به فیبروز سیستیک به شمار می آید. یکی از آنزیم های مهم در تولید و تجزیه آلژینات، آلژینات لیاز (algl) نامیده می شود. در این پژوهش هدف، استخراج و تخلیص نسبی آنزیم algl ، تعیین برخی ویژگی های آن و همچنین بررسی اثر آن روی آلژینات جدا شده ازp. aeruginosa 8821m می باشد. در این پژوهش آنزیم algl، از باکتری p. aeruginosa جدا شده از خلط بیمار تنفسی استفاده شد. این آنزیم در فضای پری پلاسمیک باکتری وجود دارد و با روش شوک حرارتی استخراج گردید. میزان فعالیت آنزیم به وسیله روش تیوباربیتوریک اسید (tba) سنجیده شد. اثر زمان های مختلف در معرض گذاری سوبسترا و آنزیم، غلظت سوبسترا، ph و دما بر فعالیت آنزیم بررسی گردید. همچنین پایداری گرمایی (فعالیت باقیمانده) آنزیم در دماهای 37 تا 80 درجه سانتی گراد بررسیشد. نتایج نشان داد که این آنزیم در غلظت 4/0 میلی گرم بر میلی لیتر سوبسترا، در زمان 20 دقیقه در معرض گذاری با سوبسترا، در دمای 37 درجه سانتی گرادو ph 5/8 بیشترین فعالیت را دارد. همچنین آنزیم در دمای 37 درجه سانتی گراد بیشترین پایداری دمایی را نشان داد. به دلیل مقاومت گرمایی بالای آنزیم algl در دمای 80 درجه سانتیگراد، آنزیم در ساعت های مختلفی در دمای 80 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد و بعد از 4 ساعت هنوز 33/31% فعالیت داشت. این آنزیم علاوه بر تاثیر بر آلژینات جلبکی بر آلژینات باکتریایی موثر است که بسیار مهم می باشد. برای تخلیص آنزیم alglاز روش رسوبگذاری با نمک آمونیوم سولفات و کروماتوگرافی ستونی تعویض یونی deaesepharose cl-6b استفاده شد و سپس آنزیم روی ژل الکتروفورز حاوی sds برده شد. در روش رسوبگذاری با نمک آمونیوم سولفات آنزیم در غلظت 50% از نمک آمونیوم سولفات رسوب کرد. آنزیم به ستون متصل شد و در غلظت 1/0 مولار از نمک nacl از ستون جدا گردید. وزن مولکولی آنزیم حدود 60 کیلو دالتون تخمین زده شد. آنزیم algl بررسی شده به دلیل مقاومت گرمایی بالا و تاثیرگذاری روی آلژینات های استیله باکتریایی بسیار مهم می باشد و می تواند در تخریب بیوفیلم های ایجاد شده به وسیله سویه های موکوئیدی pseudomonas به کار رود.